Bệnh vi khuẩn của tôm: Bệnh vi khuẩn hoại tử gan tụy Necrotizing Hepatopancreatitis – NHPB

Gan tụy là cơ quan trọng yếu liên quan đến quá trình tiêu hóa thức ăn, hấp thụ và dữ trự dinh dưỡng của tôm. Lần đầu tiên bệnh vi khuẩn hoại tử gan tụy Necrotizing Hepatopancreatitis – NHP được báo cáo ở Texas vào năm 1985 làm tôm chết và gây thiệt hại lớn về kinh tế ở khắp các trang trại nuôi tôm ở Trung và Nam Mỹ, do đó bệnh này còn có tên “Hội chứng tử vong trong ao ở Texas”(TNHP). Mức độ tăng trưởng và sinh sản của NHP trong các tế bào biểu mô gan tụy hình ống có liên quan đến tình trạng chán ăn, lờ đờ, teo cơ vùng bụng, mềm vỏ, chậm lớn và chết ở mức độ 20-95%.

Vào tháng 1 và 2 năm 1993, dịch bệnh NHP nặng nề đã bắt đầu ảnh hưởng lớn đến các trại nuôi tôm penaeid thương phẩm ở vùng Tumbes thuộc tây bắc Peru và các vùng gần Ecuador. Kiểm tra mô bệnh học và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của tôm Penaeus vannamei ấu niên bị nhiễm đã cho thấy sự lây nhiễm nghiêm trọng ở gan tụy bởi loài vi khuẩn nội bào gam âm nhiều hình thể. Tác nhân có tên gọi là Peru NHP (PNHP) căn cứ vào vị trí địa lý xảy ra và loại thương tổn có liên quan. Dịch bệnh này đã làm cho 44 trang trại đang hoạt động ở Peru bị ảnh hưởng nặng nề và đã bị đóng cửa vào tháng 6 năm 1993.

Dịch bệnh bùng phát tại hầu hết các nước Mỹ Latin ở cả hai bờ biển Đại Tây Dương và Thái Bình Dương bao gồm Mỹ, Brazil, Belize, Costa Rica, Columbia, Ecuador, Guatemala, Nicaragua, Mexico, Panama, Peru và Venezuela.

Bệnh vi khuẩn hoại tử gan tụy NHP gây ra bởi loài vi khuẩn gây bệnh, cơ thể loại Rickettsia, kích thước tương đối nhỏ, đa hình thể, gam âm nội bào bắt buộc. Vi khuẩn NHP có hai hình thái học khác nhau dễ nhận diện: một là vi khuẩn hình que (0,3 x 0,9µm) đa hình thể nhỏ và thiếu tiên mao (lông roi); hai là vi khuẩn hình que xoắn ốc dài hơn (0,2 x 2,6 – 2,9µm) có 8 tiên mao (lông roi) ở đỉnh gốc của vi khuẩn và 1 – 2 tiên mao phụ (có thể là) trên chỏm xoắn. Vi khuẩn NHP là một loài mới trong nhóm vi khuẩn alpha proteobacteria được phân loại dựa trên việc phân tích trình tự gen vô tính 16S rDNA và có liên quan chặt chẽ đến vi khuẩn nội cộng sinh khác thuộc sinh vật đơn bào: Caedibacter cryophila và Holospora obtusa. Vi khuẩn NHP được tìm thấy tự do trong tế bào chất của các tế bào gan tụy bị nhiễm bệnh. Phương thức lan truyền bệnh theo phương ngang qua nguồn nước ao bị ô nhiễm (trong phân) và/ hoặc cảm nhiễm qua đường miệng (ăn thịt đồng loại). Chu kỳ sống của loài vi khuẩn này chưa xác định được vì chưa có khả năng nuôi cấy trong ống nghiệm. Các yếu tố như nhiệt độ cao (29 – 35 độ C) và độ mặn (20 – 40 ppt) có liên quan đến các triệu chứng lâm sàng rõ rệt, vật chủ trung gian và ao lắng. Tỉ lệ chết có thể từ 90 – 95% trong vòng 30 ngày của một đợt dịch. Giai đoạn tôm bị lây nhiễm: hậu post, ấu niên và trưởng thành. Môi trường gây bệnh là nước ngọt, nước lợ và nước biển. Vi khuẩn NHP đã được báo cáo trên nhiều loại tôm penaied khác nhau ở cả nước lợ và nước biển: Penaeus vannamei (white shrimp) và P. stylirostris (Pacific blue shrimp), P. aztecus (northern brown shrimp), P. californiensis (yellowleg shrimp) và P. setiferus (northern white shrimp).

Tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) bị hoại tử gan tụy. Nhận thấy sậm màu ở chân bơi, nặng mùi, “bẩn” bề mặt.

Tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) bị hoại tử gan tụy. Nhận thấy giảm kích thước gan tụy rõ rệt.

Chẩn đoán sơ bộ

Mức 1: Các dấu hiệu lâm sàng về tổng quan có thể cho biết tôm nuôi nhiễm bệnh NHP: tuyến tiêu hóa (gan tụy) bị suy yếu từ nhợt nhạt đến trắng, quan sát có các dấu hiệu: lờ đờ, giảm hấp thụ thức ăn, hệ số chuyển đổi thức ăn cao, bỏ ăn, giảm tăng trưởng rõ, tỉ lệ trọng lượng chiều dài kém (“đuôi mỏng”), gầy mòn, vỏ mềm, thân nhũn, mang sậm hoặc đen, teo gan tụy. Kiểm tra ở mép ao, tôm bị nhiễm rỗng ruột và bề mặt nặng mùi do ngoại ký sinh gia tăng và các bệnh viêm nhiễm cơ hội khác (nghĩa là đốm đen). Bệnh do vi khuẩn liên quan đến vỏ bao gồm tổn thương loét biểu bì hoặc mòn phần phụ bị đen, và tế bào sắc tố phát triển dẫn đến xuất hiện rìa đen ở chân đuôi và chân bụng. Gan tụy bị teo và có một số đặc điểm sau: mềm và ướt, giữa đầy dịch, xanh xám và sọc đen (tế bào ống bị đen). Tỉ lệ chết tăng dần hơn 90% có thể xảy ra trong vòng 30 ngày khi bắt đầu có dấu hiệu lâm sàng nếu không được điều trị.

Mức 2: Soi tươi gan tụy bị nhiễm vi khuẩn NHP có thể thấy giảm hoặc thiếu giọt lipid và/ hoặc tế bào gan tụy hình ống bị đen

Mức 2: Sự biến đổi mô bệnh học chủ yếu do vi khuẩn NHP bao gồm viêm nhiễm huyết tương giữa các ống đáp ứng hoại tử gan tụy, phân hủy tế bào và tróc tế bào biểu mô gan tụy hình ống. Mô ống gan tụy teo rõ rệt dẫn đến hình thành vùng phù rộng (đầy dịch hoặc “lỏng”). Các tế bào biểu mô hình ống trong thương tổn u hạt đặc thù bị teo và giảm từ mô bì trụ đơn sang mô hộp về hình thái. Chúng chứa một ít hoặc không có không bào dự trữ lipid và giảm rõ rệt hoặc không có không bào bài tiết.

 Chẩn đoán xác định 

 Mức 3: Phương pháp Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), phương pháp thấm điểm (dot blot) cho vật nuôi không có triệu chứng bệnh, phương pháp lai tại chỗ (in-situ hybridization), phương pháp phản ứng chuỗi polymer hóa PCR

Các biện pháp kiểm soát

Đề xuất định kỳ lấy mẫu và kiểm tra (qua mô bệnh học, TEM hoặc mẫu dò gen) ở các trang trại có lịch sử bị bệnh NHP và ở các điều kiện môi trường thuận lợi cho dịch bệnh bùng phát. Nếu bệnh được phát hiện sớm thì có thể dùng oxytetracycline trộn vào thức ăn để điều trị. Có một số căn cứ cho thấy các ao có độ sâu hơn (2m) và sử dụng vôi thủy phân Ca(OH)₂ để xử lý đáy ao trong giai đoạn chuẩn bị trước khi thả có thể giảm xảy ra bệnh NHP. Các biện pháp ngăn ngừa có thể là cào vét bùn và ủi đáy ao, kéo dài phơi nắng đáy ao và hệ thống kênh dẫn nước trong nhiều tuần, tẩy trùng đồ dùng và các thiết bị trong trại bằng calcium hypochlorite, phơi khô và tăng cường rải vôi. Thả giống sạch bệnh SPF và áp dụng triệt để quy trình nuôi an toàn sinh học.

Thử nghiệm truyền nhiễm vi khuẩn hoại tử gan tụy ở tôm post thẻ chân trắng Litopeneaus vannamei

Thử nghiệm trên tôm thẻ chân trắng Litopeneaus vannamei post 15 sạch bệnh SPF cho cảm nhiễm qua đường miệng vi khuẩn gây hoại tử gan tụy NHP. Sau giai đoạn 2 ngày thích nghi môi trường ao nuôi, tôm thẻ chân trắng Litopeneaus vannamei post 15 sạch bệnh (dòng KONA – nguồn tôm làm thực nghiệm “đối chứng” để phục vụ các nghiên cứu quan trọng) được nhận từ Viện Hải Dương Hawaii, 200 cá thể được đưa vào 2 bể thể tích mỗi bể khoảng 300 lít. Sau giai đoạn nhịn ăn 24 giờ, đưa vào mỗi bể 3.0g mô gan tụy mềm ướt đã xét nghiệm PCR, kết quả dương tính hoặc âm tính sạch bệnh SPF. Mô gan tụy gây bệnh thử nghiệm đã xác định âm tính cho sinh trưởng trong môi trường thạch TCBS sau 24 giờ ủ ở nhiệt độ 37 độ C. Mô đã nhiễm NHP xét nghiệm PCR dương tính lấy từ một bể truyền nhiễm NHP đã thả tôm cỡ 10 – 20g bị phơi nhiễm với vi khuẩn NHPB trong giai đoạn từ 31 – 40 ngày. Tỉ lệ sống từ các bể gây bệnh thử nghiệm NHP ở các mức từ 0 – 6% và từ 70 – 86% ở các bể đối chứng SPF (bảng 1) trải qua giai đoạn từ 21-25 ngày (Biểu đồ 1). Chẩn đoán PCR (Lightner) NHPB được thực hiện trong và sau mỗi nghiên cứu. Ở các ao đối chứng âm tính sạch bệnh SPF xét nghiệm PCR vẫn âm tính trong khi tôm gây bệnh NHP thử nghiệm gần chết đã xét nghiệm dương tính ở ngày 15 và ngay khi kết thúc nghiên cứu. Các thử nghiệm này chứng minh rằng tôm post Litopeneaus vannamei dễ mắc bệnh và chết vì vi khuẩn hoại tử gan tụy NHPB. Thử nghiệm này đã sử dụng tôm post để gây bệnh cùng một lúc trên số lượng lớn các cá thể. Kỹ thuật gây bệnh thử nghiệm sẽ hữu dụng để xác định các mức độ độc khác nhau của dòng NHPB và để đánh giá trên số lượng lớn các cá thể và các dòng về sự đề kháng di truyền.

Bệnh vi khuẩn hoại tử gan tụy NHP lây nhiễm tôm cái sinh sản Penaeus vannamei: ảnh hưởng đến các thông số sinh sản, chất lượng nauplii và larvae

Ngoài việc bệnh NHP có thể làm tỷ lệ tôm chết cao ở trong các ao nuôi thương phẩm thì đây cũng là vấn đề đang được xem xét ở các ao nuôi tôm bố mẹ và giai đoạn thành thục thí nghiệm bởi sự gia tăng tỉ lệ tôm bố mẹ chết ở Columbia. Để đánh giá các tác động phụ tiêu cực, tác động lây nhiễm NHP đã được điều tra trên hoạt động sinh sản của tôm mẹ và tác động lây nhiễm của mẹ sang chất lượng ấu trùng nauplii và tôm con. Tôm trưởng thành P. vannamei (>35g) được chọn lọc từ ao nuôi bố mẹ đã xác nhận nhiễm NHP qua phân tích mô bệnh học theo triệu chứng và tỉ lệ sống cuối cùng của ao là 12,5% trong giai đoạn nuôi tôm bố mẹ. Các con còn sống sót được thả ở bể thí nghiệm thành thục. Sau giai đoạn thích nghi môi trường ao nuôi, 1000 tôm cái được cắt mắt và thả theo tỉ lệ cái đực là 1:1,35 trong các bể sợi thủy tinh màu đen với mật độ 6 con/m₂. Nước được thay hàng ngày (300%), nhiệt độ duy trì ở 28 độ C và độ mặn 35 ppt. Chế độ ăn gồm 50% mực, 15% giun tơ, 30% artemia và 5% công thức thức ăn thương phẩm, chia thành 4 khẩu phần ăn bằng nhau và được điều chỉnh để bằng tổng lượng cung cấp hàng ngày tương đương 25% trọng lượng tôm sống. Tôm bố mẹ từ các ao bị nhiễm NHP được chuyển đến một phòng thí nghiệm thành thục sinh sản. Sau khi giao vỹ, tôm cái được chuyển đến từng bể sinh riêng thể tích 250 lít nước biển lọc (độ mặn 30 ppt và nhiệt độ 30 độ C). Sau khi sinh, tôm cái được đưa phân tích PCR và mô bệnh học, trong khi đó trứng được để trong từng bể riêng để ương. Tôm cái được chia thành 3 nhóm theo các dữ liệu thu thập phân tích mô bệnh học. NHP Âm tính (n= 23) không có thương tổn NHP, NHP dương tính có thương tổn cấp 1 (n= 20) và NHP dương tính có thương tổn cấp 2 (n=12). Số lượng trứng và tỷ lệ phần trăm ương và số lượng ấu trùng trên từng cá thể tôm cái được phân tích đối với mỗi nhóm. Kết quả cho thấy tôm cái bị NHP tổn thương độ 2 giảm đáng kể số lượng trứng và ấu trùng nauplii (P<0.05) so với tôm cái NHP âm tính và tôm bị NHP thương tổn cấp 1. Không tìm thấy sự khác biệt lớn trong tỉ lệ phần trăm ương giống giữa 3 nhóm.

Bởi bệnh NHP chủ yếu gây tổn thương gan tụy và suy yếu chức năng của nó trong việc vận chuyển và dự trữ lipid. Sự chuyển hóa lipid từ gan tụy đến buồng trứng theo đường huyết dịch trong quá trình thành thục buồng trứng đã từng được chứng minh ở tôm cái Penaeus japonicas (Teshima và các tác giả khác, 1989). Quan sát thấy có sự gia tăng của tổng hàm lượng lipid trong buồng trứng ở các loài Penaeid và kèm theo giảm tổng mức lipid trong gan tụy ở hầu hết các loài, vì thế gan tụy được cho là nguồn gốc làm cho lipid của buồng trứng bị tích lũy (Wouters và các tác giả khác, 2001). Tuy nhiên bằng chứng cho thấy phần lớn lượng lipid bị tích lũy của buồng trứng, bắt nguồn từ chế độ ăn và không phải từ sự tổng hợp lipid lại từ đầu, là quá thấp để góp phần đáng kể vào sự gia tăng lipid của buồng trứng (Wouters và các tác giả khác, 1999). Xét ra bệnh NHP tác động nghiêm trọng đến gan tụy và giảm rõ rệt quá trình hấp thụ thức ăn, nó có thể làm cản trở hàm lượng lipid của buồng trứng do giảm vận chuyển và dự trữ lipid và hạ mức tiêu thụ lipid trong chế độ ăn. Khi ương giống, giai đoạn phát triển nauplii và giai đoạn biến thái đến zoea cần nhu cầu năng lượng lớn được chuyển từ tôm cái.

Mức triglyceride ở giai đoạn nauplii II ở tôm cái NHP âm tính cao hơn nhiều tôm cái NHP thương tổn cấp 2 (P<0.05), trong khi không có sự khác nhau giữa tôm cái NHP âm tính và thương tổn cấp 1. Không nhận thấy sự khác nhau đáng kể đối với mức glucose và cholesterol ở nauplii trong 3 nhóm.

Không nhận thấy sự khác nhau ở tỷ lệ sống ở giai đoạn zoea 1, mysis 1, PL-1 và PL-10 ở cả 3 nhóm. Tuy nhiên, sau khi thí nghiệm gây stress bởi độ mặn, tỷ lệ sống của PL-10 giảm đáng kể trong giai đoạn tôm bột từ tôm cái NHP dương tính và cũng quan sát thấy chiều dài của PL-10 giảm nhiều ở nhóm tôm cái NHP tổn thương cấp 1 và 2.

Nghiên cứu này đã chứng minh bệnh NHP ở tôm cái sinh sản ảnh hưởng cả đến tuổi thành thục và ương tôm bột, làm giảm số lượng trứng và ấu trùng trên từng tôm cái, giảm mức triglyceride ở nauplli II và giảm sự tăng trưởng của tôm bột và sức đề kháng đối với stress thấm lọc ở môi trường độ mặn cao ở giai đoạn PL-10.

Độ phóng đại cao (1700x) nhìn một góc của gan tụy. Tế bào biểu mô hình ống HP cho thấy không có giọt lipid trong tế bào chất, nhưng thay vào đó chứa khối lượng lớn vi khuẩn NHP nhỏ xíu, không màng bao trong nội tế bào chất (mũi tên). 

Độ phóng đại cao hơn (900x), chụp vi ảnh của gan tụy bị teo từ tôm thẻ chân trắng ấu niên bị bệnh NHP mãn. Ngược lại với giai đoạn bán cấp bệnh NHP, giai đoạn bệnh NHP mãn cho thấy không có, hoặc chỉ thỉnh thoảng, ổ viêm nhiễm gan tụy của tế bào ống gan tụy bị hoạt tử hoặc suy thoái. Vi khuẩn NHP có thể tìm thấy trong tế bào chất của tế bào gan tụy. 

TEM (10000x) Kính hiển vi điện tử truyền qua phóng đại 10.000 lần tế bào gan tụy từ tôm thẻ chân trắng ấu niên bị nhiễm bệnh NHP. Mặt nghiêng của vi khuẩn NHP nội bào hình que (mũi tên lớn) và hình xoắn ốc (mũi tên nhỏ) xuất hiện nhiều trong tế bào chất.

 Phòng Kỹ thuật – Công ty TNHH CNSH A.T.C   

Tổng hợp các nguồn     

Iowa State University Animal Industry Report 2008     

World Organization for Animal Health      

Asia Diagnostic Guide to Aquatic Animal Diseases NACA/FAO/OIE     

Elsevier.com     

Australian Government – Department of Agriculture, Fisheries and Forestry  

Nguồn hình ảnh: DV Lightner.